人们开发的这项“CRISPR/Cas9”技术，源自原核生物的一种天然免疫系统。
　　其中，“CRISPR”是指“规律成簇的间隔短回文重复”（ClusteredRugularlyInterspacedShortPalindromicRepeats），它是原核生物基因组内部的一段序列。
　　当病毒入侵原核生物时，会将自己的“一段序列”整合到原核生物体内，让后者为自己提供“养分”，使得病毒自身的基因得以复制。而这“一段序列”，正好与CRISPR序列相匹配。
　　为了抵御病毒的入侵，原核生物将病毒的这“一段序列”储存至自身，将其作为“对感染的记忆”。当它再次遭遇病毒时，便能够对入侵者加以“识别”，将病毒的这“一段序列”进行切割，使其失去作用。
　　而“Cas”是指“与CRISPR相关”（CRISPR-associated），这些“Cas”编码的“Cas蛋白”，就具有切割病毒基因的功能——“Cas9蛋白”就是其中的一员。
　　那么原核生物的CRISPR序列，是如何引导Cas9上前，继而进行切割作业的呢？
　　答案是“RNA分子的相互作用”。
　　CRISPR序列转录加工为RNA分子，该RNA与自身反式激活形式的RNA组成复合物，Cas9能够识别并结合其序列，最后对其进行切割。
　　当年顺际宁越讲越兴奋：“现在呀，不管是细胞，还是各类动物、植物，几乎都能用CRISPR/Cas9进行‘基因定点编辑’，算得上是‘指哪打哪’啦——‘切断’了特定的基因，也就相当于突变体咯。”
　　“我有预感，这项技术迟早是要拿诺贝尔奖的！”
　　顺际宁对其十分看好：“我已经和尹老师商量过了，等我们拿到了特定的载体，就可以自行使用CRISPR/Cas9体系，试着给斑马鱼做基因编辑。”
　　事实证明，顺际宁确实很有远见。
　　2020年10月，CRISPR/Cas9系统的其中两位开发者，最终被授予了诺贝尔化学奖——短短8年间，全世界形形色色的分子生物学实验室，几乎都在使用这项技术。钱余、陈幸、郭子昱、小帅……无论研究何物种，科研人员都能利用CRISPR/Cas9体系，进行基因切割操作。
　　章程澜问道：“钱老师，您当年在高校里，是怎么获得突变体的呀？”
　　“要想开展‘突变体计划’，我们首先需要运用不同的技术手段，获得大量斑马鱼的突变体——当年，我们其实尝试过好几种方式。”
　　钱余接着问道：“大家……都知道哪些斑马鱼的基因突变技术呢？”
　　学生们七嘴八舌，纷纷抢答。
　　“可以对斑马鱼进行ENU化学诱变处理。”
　　“还有TALEN靶向基因敲除技术。”
　　“可以利用CRISPR/Cas9系统！”
　　“还可以导入‘外源片段’，通过‘荧光蛋白体系’，将其作为‘报告基因’，大规模筛选‘转基因鱼’。”
　　听完学生们的答案，钱余赞许地点了点头：“那我们今天先来说说，如何获得斑马鱼突变体吧。”
　　“其实大家刚刚提到的这些操作，可以大致分为‘正向遗传学’和‘反向遗传学’两类手段。”
　　正向遗传学，是通过自发突变或者人工诱变技术，由个体表型、性状的改变，从而寻找引起此变化的对应突变基因。
　　“正向遗传学是从表型的改变入手，进而确定基因的变化。简而言之，就是我们得到了一些‘长得与众不同’的斑马鱼，继而找出引起它们‘外貌变化’的‘祸首基因’。”
　　大规模的随机突变，就是正向遗传学常用的手段——譬如，小帅开展的拟南芥种子“EMS化学诱变”。
　　“对于斑马鱼而言，‘ENU诱变’、逆转录病毒介导的‘插入突变’、转座子介导的‘基因/增强子诱捕突变’，都属于正向遗传学的研究手段。”
　　其中，ENU即“N-乙基-N-亚硝基脲”，是一种人工合成的烷化剂，能导致多种生物的DNA分子，发生随机的单碱基突变——通过烷化反应，ENU将乙烷基转移至DNA碱基的氧原子或者氮原子上，在DNA进行复制时，致使碱基错配或置换。
　　因此ENU也如同EMS诱变剂，同样被列入了致癌物清单。
　　“而逆转录病毒介导的突变原理，则是将外源DNA导入斑马鱼基因组，实现整合后，导致插入位点所对应的基因无法正常表达。”
　　钱余继续开了口：“虽然逆转录病毒介导的插入突变，可将DNA片段作为‘分子标记’，简化了后续突变基因定位、鉴定的程序——但这一操作引起的突变效率，远不如ENU化学诱变。”
　　“于是，有更多的研究者倾向于利用转座子，寻找新的未知基因。”
　　转座子，又称“跳跃基因”，它是一类可自行复制，在染色体间进行“跳跃移动”的DNA序列。例如，它能从染色体的一个位置，转移至另一个位置上。这一现象，会给基因组引进新的遗传因素——包括基因的缺失、重复、倒位、DNA重排等等。
　　“在斑马鱼的研究体系里，常用的有‘Tol2’和‘睡美人SleepingBeauty’两种转座子，它们能够将外源DNA进行‘复制/剪切’，然后‘粘贴’整合至基因组中。同时通过‘荧光蛋白报告基因’系统，让研究者得以进行大规模筛选，得到具有‘组织表达特异性’的‘转基因’斑马鱼……”
　　介绍完正向遗传学的常规手段，接下来的内容，就属于反向遗传学的范畴了。
　　“反向遗传学，是通过‘改变’某‘特定’基因，例如开展碱基的插入、替换、缺失、点突变等，进而确定这些‘DNA重组’操作，对于个体表型和性状的影响。”
　　如果把正向遗传学比作一项“由表及里”的工程，那么反向遗传学，就是另外一条“由里及表”的路线了。
　　小帅所述的SALK生物研究所，其在TAIR网站贩卖的拟南芥T-DNA插入突变体，就是一个应用反向遗传学的成功案例。
　　“开展反向遗传学的研究，是在获知斑马鱼基因组的序列前提下实施的。”
　　钱余接着往下讲解。
　　“我们可以利用‘锌指核酸酶ZFN’技术，以及‘转录激活因子样效应物核酸酶TALEN’技术，或者‘CRISPR/Cas9’系统——它们都属于反向遗传学常用的手段。”
　　如今，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9已经是“基因组编辑”的“三大利器”，它们能让研究人员针对“靶标序列”，实行“精准敲除”。
　　“这几项技术，都涉及了DNA双链损伤、断裂后的两种修复机制。”
　　DNA分子的组成与结构发生变化，导致遗传特性改变的现象，称为“DNA损伤”——而“DNA双链断裂”就是细胞内危害性很强的一种DNA损伤方式。
　　“若损伤发生时，存在与损伤DNA同源的序列片段，此时最常见的一种修复方式，就是‘同源介导的重组修复’。”
　　损伤部位被识别后，机体剪切DNA损伤末端，使其成为单链。单链进而侵入另一条同源链，形成“交叉”结构——它将该同源链作为模板，进行碱基互补配对、DNA合成及延伸，最终“交叉”支点迁移、切断，DNA完成修复。
　　同源重组修复过程中，DNA分子发生了交换与重新组合。
　　“若损伤发生时，细胞没有可依赖的同源DNA片段，则可能发生‘非同源末端连接’现象——机体首先将断裂端进行处理、加工，然后‘强行’将两个断裂端彼此相连。”
　　“这类修复机制，并非是一种‘忠实’的手段。它直接将DNA末端进行连接，在很大程度上会引起序列的丢失、移位、染色体重排等，导致基因突变。”
　　非同源末端连接，算得上是一种“简单粗暴”的修复方式。
　　钱余建议道：“我们首先讲一讲锌指核酸酶ZFN（zinc-fingernuclease）。”
　　“这是一个嵌合结构，顾名思义，ZFN包括锌指及核酸酶。”
　　经由人工改造合成的ZFN，含有“锌指DNA识别结构域”和非特异性的“核酸内切酶结构域”。前者能够识别并结合DNA碱基，后者则具有剪切DNA的功能——对于后者而言，ZFN技术使用最频繁的“切割结构域”，来自于限制性内切酶FokⅠ。
　　“人们将这两个结构域巧妙地连接在一起——使用者针对目的基因，设计并合成特异的ZFN，使其对DNA进行切割，形成‘双链断裂’现象。”
　　“在不含‘供体DNA’的情况下，双链断裂区可通过‘非同源末端连接’作用，随机删减或添加碱基，造成移码突变，从而使目的基因失活。”
　　“当存在‘供体DNA’时，双链断裂后可以通过‘同源重组修复’作用，引入特定的核苷酸变化或者基因片段。”
　　钱余紧接着摇了摇头：“ZFN技术虽然简单、实用、操作性强，但它在剪切DNA时，两个切割区域一旦自行形成‘异源二聚体’，便容易产生‘脱靶效应’，造成DNA的错配。”
　　于是，人们又开发了另一项基因编辑技术，名称是转录激活因子样效应物核酸酶TALEN（transcriptionactivator-likeeffectornuclease）。
　　“TALEN操作的原理，其实和ZFN是类似的。”
　　科研人员在黄单胞菌中发现了一种“TAL效应因子”，称为“TALE”（TALeffector）——这种蛋白能够特异性识别DNA序列。
　　“人工打造带有‘进入细胞核指令’的TALE结构域，将其与非特异性核酸内切酶FokⅠ连接起来，就组成了TALEN的技术核心——精准识别DNA序列，并对其实施切割操作。”
　　“相较于ZFN，TALEN技术的特异性更高，能够识别更长的‘靶向’序列。但TALEN的组装操作更繁琐，需要进行大量的测序工作——简而言之，运用TALEN这项技术，成本是相对较高的。”
　　蓝西氿开口问道：“就是因为这些原因，所以人们更倾向于应用CRISPR/Cas9技术吗？”
　　钱余点了点头：“CRISPR/Cas9系统确实有优势。”
　　“作为新一代的基因编辑技术，CRISPR/Cas9是一把由RNA介导的‘定向剪刀’，”
　　简单来讲，CRISPR/Cas9系统的工作原理，就是原核生物识别外源侵入的DNA序列，然后对该序列进行降解的过程。
　　“当外源DNA入侵、整合至CRISPR序列时，后者经过转录、加工，形成crRNA（CRISPR-derivedRNA）。部分crRNA被反式激活为tracrRNA（trans-activatingRNA），接着这两类RNA相互嵌合形成复合物。待核酸酶Cas9进行识别后，它会在与crRNA配对的序列‘靶点’处剪切双链DNA。”
　　“当双链断裂后，细胞便会启动DNA修复功能，从而引入基因突变。”
　　“因此，CRISPR/Cas9是通过RNA的相互作用，实现对基因序列的识别与编辑。”
　　“只需将上述两种RNA嵌合成一段‘向导RNA’，再通过与‘靶基因’的碱基配对，将Cas9引至‘靶位点’，令其识别并切割目的基因，最终完成对基因组的编辑。”
　　相比之下，无论是ZFN还是TALEN技术，都必须依赖各自的DNA识别结构域——使用者需要进行一番繁琐、费时的操作，以确保人工合成准确无误的“DNA结合模块”。
　　但CRISPR/Cas9技术却相对简单，只需设计一段RNA序列即可。
　　钱余做了总结：“CRISPR/Cas9技术的‘脱靶率’较低，工序更为简单、快捷、高效，而且成本低廉，因此深受广大科研人员的喜爱。”
　　有学生再次提问：“钱老师，如今有这么多获得突变体的手段……那我们应该如何选择呢？”
　　“你们认为呢？”钱余反问道。
　　博士生又率先开了口：“我觉得，不能把希望都放在同一种方式上。”
　　钱余点头赞同：“换句话说，我们可以将正向和反向遗传学的手段进行联用。”
　　“ENU化学诱变剂，能够广泛应用于斑马鱼的各个发育阶段，其诱变效率也很高，是筛选各器官发育突变体的重要手段。”
　　“只要我们使用ENU时做好防护，后期做好废液回收处理，就能杜绝试剂污染问题。”
　　“同时，以Tol2转座子为基础，结合荧光蛋白体系，获得组织表达特异性的‘转基因鱼’，也可以筛选新的未知基因。”
　　“再利用CRISPR/Cas9系统，辅助基因编辑。譬如，可以将同一家族的几个关键基因‘集体沉默’，进一步寻找该发育信号通路中的其它潜在因子……”
　　在这一次组会上，钱余和学生们讲明了自己的“突变体计划”，首次探讨了“如何获得斑马鱼突变体”这一问题。
　　“当然了，这只是初步的计划，具体的实施还需要我们进一步细化。”钱余补充道，“关于突变体的筛选及鉴定，我们也会在今后的工作中继续讨论……”
　　显而易见，钱余是一名对科研有规划的导师。
　　或许是他自己经历过“没有课题”的处境，因此钱余深知“凡事预则立”之理。但这挖掘课题的计划，能否经受住技术瓶颈、耗时长、经费短缺的考验，目前尚未可知。